由于可電離化合物的保留對流動相 pH 值非常敏感，因此必須通過添加緩沖液來控制流動相的 pH 值。 添加少量酸或堿時，緩沖液可保持 pH 值。 許多不同的物質已用于 HPLC 中的緩沖。

用于帶 UV 檢測的 HPLC 的zui常用緩沖液是磷酸鹽和醋酸鹽。 磷酸鹽和醋酸鹽是特別有用的緩沖液，因為它們可以在低于 220 nm 的波長下使用。

當質譜儀用作 LC 檢測器 (LC-MS) 時，流動相必須是揮發性的，因為 LC-MS 接口的功能之一是使流動相汽化。 這意味著不能使用zui常用的 LC-UV 工作緩沖液磷酸鹽。 幾種緩沖液的揮發性足以滿足 LC-MS 使用的要求。 LC-MS 應用中zui常見的 HPLC 緩沖液是醋酸鹽、TFA (0.1%)、甲酸、甲酸銨和碳酸氫銨。