一、 DEMO說明
在色譜柱柱效測試時，有較多因素影響柱效測試結果，我們于此特列出各種影響及注意事項。
二、 柱效測試影響因素
1.系統擴散體積
定義：系統擴散體積影響色譜柱性能，包括進樣器到流通池的體積。 儀器系統擴散體積是指對色譜柱性能有很大影響，尤其是小顆粒色譜柱。
圖1
儀器本身死體積具體影響：
2.1*50mm 1.6μm CORTES C18 乙腈/水=70:30（v/v）
0.4ml/min 0.5ul 丙酮，苯，二氫苊
結論：死體積增加會降低柱效、會發生額外擴散、柱效降低。小內徑色譜柱（2.1mm）或體積較小的色譜柱受柱外體積影響，對柱效的影響更大。
案例1:
色譜柱：
ACQUlTY UPLC BEH C 18, l.7 μm, 2.1 mm X 50 mm (PN 186002350）測試二氫苊
附：測試系統擴散體積的方法：
用二通代替色譜柱，連接管路后，按照如下方法測試系統擴散體積。
系統擴散體積計算公式：
擴散體積位μL=4.4% 峰高處的三次平均峰寬（min）×流速（mL/min）×1000
計算示例：
2. 流動相對柱效測試結果的影響
流動相中有機相與水相的比例對峰高、 峰面積以及柱效均可能有影響。
案例2：
色譜柱：BEH C18 1.7um 2.1×50mm (PN 186002350 ）測試結果（流速：0.35ml/min)
3.不同柱效測試液
不同廠家，不同類型的色譜柱其柱效測試的化合物各不相同，如反相色譜柱可選苯、荼、苊等各種類型的檢測方法，盡量采用與廠家相同的化合物測試。
BEH C18 1.7μm 2.1x50mm測試不同化合物的結果：
Xetrra C18 5.0μm 4.6×250mm測試不同化合物的結果：
4．不同柱內徑的影響：
死體積對不同柱內徑大小有不同影響 寬內徑影響較小，窄內徑影響較大。
三、正確的柱效測試演示實驗
1. COA報告
圖8
2.儀器
高效液相色譜儀，需配備合適的檢測器（如紫外－可見檢測器、熒光檢測器等）、進樣器和色譜柱恒溫箱。
注：關注儀器的死體積情況，盡量選擇死體積小的連接管路和檢測器流通池，尤其是在使用小規格色譜柱時。
四、 操作步驟
若儀器系統之前使用過高鹽體系，建議先用純水沖洗5-10min后， 再接如下步驟操作
a) 儀器接兩通，待用管路放置新鮮有機相（乙腈或甲醇），灌注5min后先用有機相（乙腈或甲醇）沖洗系統約5min 。
b) 將色譜柱連接至系統上，以0.1ml/min開始緩慢增加流速至0.8 mL/min，小粒徑色譜柱可降低流速。用有機相（乙腈或甲醇）沖洗色譜柱，約20 min。
c) 更換柱效測試流動相， 緩慢調節流速至測定流速，平衡色譜柱，一般需5-10倍柱體積，直至壓力和基線穩定。 在平衡過程中，密切關注壓力變化，若壓力異常波動，可能存在堵塞或泄漏等問題，需及時排查。
d) 準確吸取適量測試標準品，為保證結果準確，通常重復進樣3次，記錄下每次測試數據。
e) 根據測得理論塔板數結果計算柱效，EP和USP理論塔板數有區別。
五、 注意事項
若測試結果柱效明顯偏低、 峰形拖尾、 柱壓較高，需全 面排查問題。
a） 檢查色譜柱是否污染， 可通過沖洗色譜柱或更換保護柱進行驗證。
b） 確認流動相比例是否準確。
c） 檢查儀器系統，包括連接管路是否有泄漏、 堵塞， 檢測器是否正常工作等， 同時考慮死體積是否過大對柱效產生了不 良影響。
